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ASFV荧光PCR检测操作流程,看完你学会了吗?

来源:养猪职业经理人 2019-10-10 14:30:36| 查看:

  用于非瘟病毒检测的多数试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术,适用于检测样品中的ASFV DNA。
  
  样品采集、存放及运输
  
  采集
  
  1.活猪样品,无菌采集抗凝血或者血清5ml;或者用无菌棉绳系于栏杆上任猪咀嚼,之后以无菌塑料袋收集唾液样品适量。
  
  2.病死猪剖检样品或者屠宰场样品,无菌采集死猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品;
  
  3.病死猪污染的周边环境,采集与病毒相关场所的粪便、饲料、污水样品。
  
  存放
  
  1、待测样品在2-8度保存不应超过24小时;
  
  2、-20度保存不应超过3个月;
  
  3、-70度以下长期保存,样品应避免反复冻融。
  
  运输
  
  4.采用冰壶加冰或者泡沫箱加冰密封进行运输。
  
  使用方法
  
  1、样品处理(最好是在样品处理区进行)
  
  若样品为液体,取20ul样品,加入BUFFER A 和BUFFER B 各100ul,漩涡混匀:12000rpm离心2分钟,取上清液作为模板即可直接检测;若样品为组织,取5~10毫克组织(约半个绿豆大小)放于100ul BUFFER A中,充分研磨混匀;向研磨混合物中进一步加入100ul BUFFER B ,漩涡混匀;12000rpm离心2分钟,取上清液作为模板即可直接检测。
  
  2、扩增试剂准备(PCR前准备区)
  
  从试剂盒中取出ASFV PCR反应液、Taq酶,室温融化并振荡混匀后,2000rpm离心10秒。假设所需要的PCR反应管管数为n(n=样品数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
  
  计算好各试剂的使用量,加入到一适当体积的离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10秒钟,向设定的n个PCR反应管中分别加入24ul,转移至样品处理区。
  
  3.加样(样品处理区进行)
  
  向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中所提取的DNA、阴性对照、阳性对照各1ul,盖紧管盖,将PCR反应管转移至检测区,置于PCR仪上,记录样品摆放顺序。
 
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  4.PCR扩增(检测区)
  
  循环条件设置
  
  1)95度:3分钟;2)95度:5秒钟,60度:20秒(收集荧光):45循环
  
  反应体系为25ul。
  
  仪器检测通道选择
  
  荧光信号收集时设定为Fam荧光素。
  
  5、质控标准
  
  阴性对照的Ct值应等于none。
  
  阳性对照的Ct值应小于或者等于32.0,否则,此次实验视为无效。
  
  6.结果判定
  
  1)、Ct值为none的样品为阴性。
  
  2)、Ct小于42.0的样品为阳性。
  
  3)、Ct大于42的样品建议重做。重做结果Ct值为none为阴性,否则为阳性。
  
  使用注意事项
  
  1、各区物品为专用,不得交叉使用,避免污染,实验结束后立即清洁工作台;
  
  2、反应液分装时应尽量避免气泡产生,上机检测前注意各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器;
  
  3、实验中用过的吸头请直接打入装入1%次氯酸钠的废物缸内,与其它废弃物品一同灭菌后丢弃;
  
  4、其它未尽事宜请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规范进行。
 

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