ASFV荧光PCR检测操作流程，看完你学会了吗？

来源：养猪职业经理人 2019-10-10 14:30:36| 查看：次

　　用于非瘟病毒检测的多数试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于检测样品中的ASFV DNA。

　　样品采集、存放及运输

　　采集

　　1.活猪样品，无菌采集抗凝血或者血清5ml;或者用无菌棉绳系于栏杆上任猪咀嚼，之后以无菌塑料袋收集唾液样品适量。

　　2.病死猪剖检样品或者屠宰场样品，无菌采集死猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品；

　　3.病死猪污染的周边环境，采集与病毒相关场所的粪便、饲料、污水样品。

　　存放

　　1、待测样品在2-8度保存不应超过24小时；

　　2、-20度保存不应超过3个月；

　　3、-70度以下长期保存，样品应避免反复冻融。

　　运输

　　4.采用冰壶加冰或者泡沫箱加冰密封进行运输。

　　使用方法

　　1、样品处理（最好是在样品处理区进行）

　　若样品为液体，取20ul样品，加入BUFFER A 和BUFFER B 各100ul，漩涡混匀：12000rpm离心2分钟，取上清液作为模板即可直接检测；若样品为组织，取5~10毫克组织（约半个绿豆大小）放于100ul BUFFER A中，充分研磨混匀；向研磨混合物中进一步加入100ul BUFFER B ，漩涡混匀；12000rpm离心2分钟，取上清液作为模板即可直接检测。

　　2、扩增试剂准备（PCR前准备区）

　　从试剂盒中取出ASFV PCR反应液、Taq酶，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10秒。假设所需要的PCR反应管管数为n（n=样品数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

　　计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积的离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10秒钟，向设定的n个PCR反应管中分别加入24ul，转移至样品处理区。

　　3.加样（样品处理区进行）

　　向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中所提取的DNA、阴性对照、阳性对照各1ul，盖紧管盖，将PCR反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样品摆放顺序。